Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Параметры раствора электролита
Тип и концентрация буферного раствора. Буферные растворы, подходящие для капиллярного электрофореза, имеют соответствующую буферную ёмкость в выбранном диапазоне рН и низкую подвижность для уменьшения образования тока.
Подбор соответствующей подвижности буферного иона по отношению к подвижности исследуемого вещества важен для уменьшения возможного изменения полосы. Тип растворителя, использованного для растворения определяемого вещества, также важен для достижения фокусирования вещества на колонке, что увеличивает эффективность разделения и улучшает детекцию.
Увеличение концентрации буферного раствора (для данной величины pH) уменьшает электроосмотический поток и скорость вещества.
Величина рН буферного раствора. Величина рН буферного раствора может влиять на разделение вследствие изменения заряда аналита или добавок, а также электроосмотического потока. При разделении белков и пептидов изменение рН буферного раствора от величины, превышающей изоэлектрическую точку (pI), до величины, которая меньше её, изменяет суммарный отрицательный заряд вещества на положительный. Увеличение рН буферного раствора обычно увеличивает электроосмотический поток.
Органические растворители. К водным буферным растворам для увеличения растворимости веществ, а также (или) для изменения степени ионизации компонентов образца могут быть добавлены органические модификаторы (метанол, ацетонитрил и другие). Добавление таких органических модификаторов к буферному раствору обычно вызывает уменьшение электроосмотического потока.
Добавки для хиральных разделений. Для разделения оптических изомеров к разделяющему буферному раствору добавляют хиральный селектор. Наиболее часто используемыми хиральными селекторами являются циклодекстрины, в качестве таких веществ могут быть использованы краун-эфиры, полисахариды и белки. Поскольку хиральное распознавание управляется различными взаимодействиями между хиральным селектором и каждым из энантиомеров, разрешение, достигаемое для хиральных соединений, зависит, главным образом, от типа использованного хирального селектора. В этом отношении при разработке методик определённых разделений может оказаться полезным использование циклодекстринов с различным размером полостей (а-, в- или Y-циклодекстрин) либо модифицированных циклодекстринов с нейтральными (метил-, этил-, гидроксиалкил и другие) или способными к ионизации (аминометил-, карбоксиметил-, сульфобутиловые эфиры и другие) группами. При использовании модифицированных циклодекстринов следует принимать во внимание различия в степени замещения между разными партиями данных веществ, поскольку это может оказывать влияние на селективность. Другими факторами, контролирующими разрешение при хиральных разделениях, являются концентрация хирального селектора, состав и рН буферного раствора, а также температура. Достигнутую величину разрешения также может изменять использование органических добавок, таких как метанол или мочевина.
КАПИЛЛЯРНЫЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ПРИНЦИП
В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, который действует как молекулярное сито. Поскольку более малые молекулы легче проникают в структуру геля и мигрируют быстрее, чем большие молекулы, разделение молекул с близкими величинами отношения заряда к массе происходит в соответствии с их размерами. Таким образом, методом капиллярного гель-электрофореза согласно величинам молекулярных масс могут быть разделены различные биологические макромолекулы (например, белки и фрагменты ДНК), часто имеющие близкие величины отношения заряда к массе.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕЛЕЙ
В капиллярном электрофорезе используют гели двух типов: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически
модифицированные гели, такие как поперечно-сшитый полиакриламид, получают полимеризацией мономеров внутри капилляра. Они обычно химически связаны с поверхностью плавленого кварца и не могут быть удалены без разрушения капилляра. Если гели используются для анализа белков, разделяющий буфер обычно содержит натрия додецилсульфат и пробы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси натрия додецилсульфата и 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола. В случае анализа интактного антитела 2-меркаптоэтанол и дитиотреитол не применяют. Разделение с помощью поперечно-сшитых гелей может быть улучшено при изменении буферного раствора, используемого при разделении (как указано в разделе, посвящённом капиллярному зонному электрофорезу), и контролировании пористости геля во время его получения. Для поперечно-сшитых полиакриламидных гелей пористость может быть модифицирована путём изменения концентрации акриламида и/или пропорции сшивающего реагента. Как правило, уменьшение пористости геля приводит к уменьшению подвижности разделяемых веществ. Вследствие жёсткости подобных гелей может быть использован только электрокинетический ввод пробы.
Динамически модифицированные гели представляют собой гидрофильные полимеры, такие как линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и другие, которые могут растворяться в водных буферных растворах, используемых при разделении, образуя разделяющую среду, которая также действует как молекулярное сито. Такие разделяющие среды получить легче, чем поперечно-сшитые полимеры. Они могут быть приготовлены в пробирке и помещены под давлением в капилляр с модифицированной поверхностью (без электроосмотического потока). Удаление геля после каждого ввода пробы обычно улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей может быть увеличена при использовании полимеров с большей молекулярной массой (при определённой концентрации полимера) или путём уменьшения концентрации полимера (при определённой молекулярной массе полимера). Уменьшение пористости геля приводит к уменьшению подвижности вещества для того же самого буферного раствора. Поскольку растворение таких полимеров в буферном растворе даёт
